توالییابی DNA یکی از مهم‌ترین تکنیک‌های بیولوژی مولکولی است که به تعیین ترتیب نوکلئوتیدهاییک رشته DNA می‌پردازد. این روش کاربردهای گسترده‌ای در زمینه‌های مختلف از جمله پزشکی، زیست‌شناسی، داروسازی و کشاورزی دارد.
در سال 1977، فرانسیس کریک و همکارانش روشی را برای توالییابی DNA ابداع کردند که به روش سانگر معروف شد. این روش مبتنی بر استفاده از نوکلئوتیدهای خاتمه‌دهنده است که باعث می‌شوند سنتز رشته DNA در طول‌های مختلف متوقف شود. سپس، قطعات DNA با اندازه‌های مختلف با استفاده از الکتروفورز از یکدیگر جدا می‌شوند و ترتیب نوکلئوتیدهای آنها از روی موقعیت آنها در ژل تعیین می‌شود.
روش سانگر شامل چهار مرحله اصلی است:
- دناتوره کردن DNA الگو: در این مرحله، رشته DNA دو رشته‌ای به صورت حرارتییا شیمیایی دناتوره می‌شود تا به یک رشته تک‌رشته‌ای تبدیل شود.
- افزایش DNA با پرایمر: در این مرحله، یک پرایمر کوتاه به انتهای 5' رشته الگو متصل می‌شود. پرایمریک مولکول DNA کوچک است که از نظر مکملی با انتهای 5' رشته الگو مطابقت دارد.
- سنتز DNA با DNA پلیمراز: در این مرحله، DNA پلیمراز با استفاده از نوکلئوتیدهایdNTPو پرایمر، رشته DNA جدید را در جهت 5' به 3' سنتز می‌کند.
- اضافه کردن نوکلئوتیدهای خاتمه‌دهنده: در این مرحله، نوکلئوتیدهای خاتمه‌دهنده به واکنش اضافه می‌شوند. نوکلئوتیدهای خاتمه‌دهنده یک گروه 3'-OH ندارند که برای تشکیل پیوند فسفدیسیته بین دو نوکلئوتید مورد نیاز است. بنابراین،DNA پلیمراز پس از اضافه کردن یک نوکلئوتید خاتمه‌دهنده، سنتز رشته DNA را متوقف می‌کند.
جداسازی قطعات DNA:
پس از سنتز قطعات DNA با اندازه‌های مختلف، آنها با استفاده از الکتروفورز از یکدیگر جدا می‌شوند. در الکتروفورز، قطعات DNA با بار منفی به سمت قطب مثبت حرکت می‌کنند. قطعات DNA با طول کمتر، سرعت حرکت بیشتری دارند و در انتهای ژل قرار می‌گیرند.
خواندن توالی DNA:
پس از جداسازی قطعات DNA، ترتیب نوکلئوتیدهای آنها از روی موقعیت آنها در ژل خوانده می‌شود. در ژل، قطعات DNA با طول یک واحد نوکلئوتیدی، حدود 0.3 میلی‌متر از یکدیگر فاصله دارند. بنابراین، با اندازه‌گیری فاصله بین قطعات DNA در ژل، می‌توان ترتیب نوکلئوتیدهای آنها را تعیین کرد.
کاربردهای روش سانگر:
روش سانگریکی از روش‌های اصلی توالییابی DNA است که در طیف گسترده‌ای از کاربردها استفاده می‌شود. از جمله کاربردهای این روش می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
شناسایی ژن‌ها و بیماری‌های ژنتیکی
طراحی داروها و درمان‌های ژنتیکی
مطالعه تکامل
تشخیص بیماری‌ها
مزایا و معایب روش سانگر:
روش سانگر دارای مزایای زیر است:
دقت بالایی دارد
می‌تواند DNA را با طول‌های مختلف توالییابی کند
تجهیزات مورد نیاز آن نسبتاً ارزان است
از جمله معایب این روش می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
سرعت پایینی دارد
به مهارت و تجربه بالایی نیاز دارد
نتیجه‌گیری:
روش سانگر یکی از روش‌های مهم توالییابی DNA است که کاربردهای گسترده‌ای در زمینه‌های مختلف دارد. این روش دارای دقت بالایی است و می‌تواند DNA را با طول‌های مختلف توالییابی کند. با این حال، سرعت این روش پایین است و به مهارت و تجربه بالایی نیاز دارد.
منبع : سین مورو